摘要: 本研究采用高能态臭氧，针对臭氧对禽流感病毒的体外灭活作用，臭氧对禽流感病毒的空气传播的阻断作用，及臭氧对接触传染的同居流行病学作用进行了研究。体外灭活的初步结果表明，高能态臭氧可以在短时间灭活体外的禽流感病毒，使其100% 丧失侵染的能力，并获得了完全阻断禽流感病毒的空气传播效果；同居感染的实验结果表明，高能态臭氧的施用，显著地延迟了发病时间与发病率。这一研究结果预示着，臭氧极为可能成为替代目前在禽流感卫生防控中所应用的有害的化学药剂，如甲醛等；彻底地改善目前的禽流感防疫系统，降低对禽流感疫苗的依赖性，减缓禽流感病毒的变异的速度，从而创造一个新型的、稳定的、绿色环保的公共卫生体系。
    关键词：禽流感；高能态臭氧；Ｈ５Ｎ２病毒；SPF鸡；

　　禽流感是一种由正黏病毒科A型流感病毒引起禽类从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的传染病，这类流感病毒有大量天然宿主。高致病性禽流感病毒的传播是多维的，如空气、粪便、饲料和饮水等；近年来蔓延全球的烈性禽类传染病，暴发频率呈几何级数增加，并已跨越“种间隔离”袭击和传染人类。禽流感病毒传染给人的死亡率高达60%。到目前为止，世界上大约有60人死于禽流感。如果禽流感交叉感染反复发作，病毒基因极易发生变异，就有可能造成人与人之间传播的空前灾难，后果不堪设想。禽流感问题已不仅是关系食品安全的一般问题，而是危机人类的健康、生存和发展的严重问题。如何克服目前防控体系的缺陷，降低病毒的变异速度，有效地阻断病毒的传播途径，创建新型的防控体系是解决禽流感问题的关键所在。
　　臭氧（O3）是氧(O2)的同素异构体，为暗蓝色气体，在1840年由德国的Schorbein C发现并命名。该气体是一种强氧化剂，在消毒学上属于过氧化物类消毒剂，同时具有使用方便，刺激性低作用快速杀灭病原种类多不污染环境等特点。有关研究表明，臭氧可破坏囊膜病毒的外膜蛋白中的不饱和键，这种生化作用的传递几乎是瞬时的，从而可以快速的灭活囊膜病毒。
　　本研究通过三种不同的途径（干燥病毒样品、空气中病毒、接触传染）对臭氧的灭活禽流感病毒的效果进行了研究。
　　１、材料与方法
　　１.１实验材料
　　DHX-SS-1G 实验室用高能态臭氧发生器，由哈尔滨久久电化学工程技术有限公司提供；H5N2 病毒干燥样品载玻片，H5N2 病毒悬液；负压隔离器，9-10 日龄SPF鸡胚;
　　１.２实验方法
　　１.２.１体外灭活实验
　　按照实验室用臭氧发生器使用说明书规定程序操作，对负压隔离器1立方米密闭空间内放置的涂布有禽流感病毒(H5N2株)悬液和干燥病毒样品的载波片分别进行10分钟、15分钟、20分钟和30分钟的消毒效果检测；不同处理的样品分别接种4枚9-10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，经37℃72小时孵化，去掉24小时内死胚。用0.5%鸡红血球悬液与鸡胚尿囊液做血凝实验。
　　１.２.２空气中病毒传播阻断实验
　　于两台负压隔离器内各饲养8周龄SPF鸡15只，其中一组作为对照;按照实验室用臭氧发生器使用说明书规定程序操作，保持负压隔离器温度为22℃，湿度50%，打开臭氧发生器(保持2L/min气体流量)；隔离器内通入臭氧10分钟后通过气溶胶发生器向隔离器内2ML107.5EID50/0.1mlH5亚型(H5N2)病毒悬液；继续通入臭氧60分钟后关闭臭氧发生器；7天后无菌采集隔离器内SPF鸡肺脏，对照组与实验组每只SPF鸡肺脏研磨悬液接种4枚9-10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml,经37℃72小时孵化，去掉24小时内死胚。用0.5%鸡红血球悬液与鸡胚尿囊液做血凝实验。
　　１.２.３接种后同居感染实验
　　于两台负压隔离器内各放入12只8周龄SPF鸡，各选2只接种H5N2亚型禽流感病毒，接种剂量为107.5EID50/0.1ml,肌肉注射0.2ml/只。每组其余10只SPF鸡不攻毒，作为同居感染试验；按照实验室用臭氧发生器使用说明书规定程序操作，保持负压隔离器温度为22℃，湿度50%，于攻毒后的第二天对其中一台负压隔离器接通臭氧发生器（保持2L/min气体流量，设定为每工作1小时停机10分钟）；于攻毒后第2天开始分别采集隔离器内未攻毒SPF鸡咽拭子，对照组与实验组每只SPF鸡咽拭子接种4枚11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，经37℃72小时孵化，去掉24小时内死胚。用0.5%鸡红血球悬液与鸡胚尿囊液做血凝实验；于攻毒后7天分别无菌采集隔离器内未攻毒SPF鸡肺脏，对照组与实验组每只SPF鸡肺脏研磨悬液接种4枚11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，经37℃72小时孵化，去掉24小时内死胚。用0.5%鸡红血球悬液与鸡胚尿囊液做血凝实验。
　　２、结果与分析
　　２.１体外灭活实验
　　涂布有禽流感病毒(H5N2株)悬液的品载玻片与H5N2病毒干燥样品载玻片通过20分钟的高能态臭氧的处理后，鸡胚病毒感染培养的结果均为阴性，即不能培养出禽流感病毒；而未经臭氧处理的样品则可以100%的培养出病毒。这一结果表明臭氧对禽流感病毒的体外灭活作用是100% 有效的。
　　２.２空气中病毒传播阻断实验
　　血凝检测结果是：对照组（即不施用臭氧组）的１５SPF 鸡种, 其中有１０支表现出鸡肺脏接种鸡胚尿囊液血凝实验阳性, ５是阴性，阳性率为６６．７％；施用臭氧组，１５只鸡的血凝实验均为阴性；
　　空气中病毒传播阻断实验表明，本实验所采用的病毒悬液的喷雾在隔离室内具有强的传染特性，其七天内的感染率高达６６．７％。这一点证明我们所采用的方法是研究臭氧灭活禽流感病毒的有效的模式。
　　施用臭氧组的１５只鸡的血凝实验均为阴性。这一结果表明臭氧对空气中的禽流感病毒具有１００％的灭活效果，可以充分地阻断病毒在空气中的传播，抑制空气中禽流感病毒对鸡的感染。
　　２.３接种后同居感染实验
　　对照组（即未施用臭氧组）的未攻毒10只SPF鸡与接种H5N2亚型禽流感病毒的鸡接触后第三天，其中5只咽拭子接种的鸡胚尿囊液血凝实验结果为阳性；在接触后的第四天有9只咽拭子接种的鸡胚尿囊液血凝实验结果为阳性; 在接触后的第七天，该9支鸡肺脏研磨悬液接种鸡胚尿囊液血凝实验均为阳性，其同居接触感染率高达90% 。
　　施用臭氧的实验组的未攻毒10只SPF鸡与接种H5N2亚型禽流感病毒的鸡接触后第三天的咽拭子接种的鸡胚尿囊液血凝实验未出现阳性，在第四天有5只表现出了阳性；在第七天有6只鸡的鸡肺脏研磨悬液接种鸡胚尿囊液血凝实验表现为阳性，其同居接触感染率为60% 。
　　同居感染实验的结果说明：施用臭氧表现出臭氧具有延迟接触传染时间的现象，起到了阻碍禽流感传染的作用。
　　３、讨论
　　臭氧的施用虽然表现出具有延迟同居接触传染时间的现象，起到了阻碍禽流感传染的作用，但随着时间的推移，未接种的鸡出现了病毒阳性，且感染率有升高的趋势。这一实验并没有获得如体外灭活实验、空气中阻断禽流感病毒的传播途径的实验那样的显著效果。虽然如此，我们不能简单地定论臭氧不能有效地阻遏接触传染。同居实验的传播途径是复杂的，鸡的饮用水，粪便均可以是传染源，导致鸡的感染发病；为了进一步明确臭氧对接触传染的阻遏效果，我们将在今后的实验中除了对空气进行臭氧处理外，对鸡饮用水，鸡的排泄物，以及饲料进行臭氧处理，建立一个多维的臭氧应用实验系统，科学地揭示臭氧对禽流感接触传染的阻遏作用及阻遏水平。
　　本研究的体外灭活实验证明，臭氧对禽流感病毒样品的灭活作用是100% 有效的。根据这一结果，我们认为：如果采用合理的应用工艺，臭氧可以成为有效的针对禽流感病毒的实物表面消毒剂，使臭氧成为公共卫生防疫体系的重要组成部分。
　　本研究的综合结果表明臭氧可以有效地灭活禽流感病毒与阻遏病毒的传播。臭氧极为可能成为替代目前在禽流感卫生防控中所应用的有害的化学药剂，如甲醛等；彻底地改善目前的禽流感防疫系统，降低对禽流感疫苗的依赖性，减缓禽流感病毒的变异的速度，从而创造一个新型的、稳定的、绿色环保的公共卫生体系。